菌種的長期穩(wěn)定保存是微生物研究與生產(chǎn)應用的基礎。若保存不當導致菌種失活或遺傳變異，前期實驗成果將可能前功盡棄。甘油冷凍保藏法因操作簡便、成本低、保存周期長，成為實驗室中常用的微生物保存方法之一。

作為實驗室耗材專業(yè)服務商，愛津生物始終致力于為科研人員提供高品質、穩(wěn)定可靠的耗材支持，涵蓋菌種保藏、液體操作、細胞培養(yǎng)等多個環(huán)節(jié)，助力科研實驗高效開展。

PART 01

甘油冷凍保藏法的優(yōu)勢

glycerol cryopreservation

01 長期維持菌種活力

在-80°C或更低溫環(huán)境下，添加甘油可延長微生物（如細菌、酵母等）的存活時間，通?？杀４鏀?shù)年甚至十幾年，為科研和工業(yè)提供穩(wěn)定菌源。

02 降低冰晶對細菌損傷

在冷凍過程中，水形成的冰晶會破壞細胞膜和細胞器，導致細菌死亡。甘油作為冷凍保護劑，可從以下三方面發(fā)揮作用：其一，降低溶液的冰點，使溶液在更低溫度下才會結冰；其二，減少冰晶的形成，降低冰晶的生長速度與大??；其三，與水分子結合，減少可用于形成大冰晶的自由水含量，同時穩(wěn)定細胞膜和蛋白質結構，從而有效避免細胞因冰晶形成而受損。

03 保持菌種遺傳穩(wěn)定性

超低溫幾乎阻斷微生物代謝，可有效降低基因突變或漂變的風險，有效維持菌種的原始遺傳特性，是確保實驗重復性的重要保障。

04 操作簡便 適用性廣

甘油冷凍保藏法所需材料常見、且操作步驟已形成標準化流程，新手實驗員也能快速掌握。該方法適用于大多數(shù)細菌（包括好氧菌和厭氧菌）、酵母菌、部分絲狀真菌以及某些噬菌體，不過對敏感菌種，可調整甘油濃度或搭配其他保護劑（如 DMSO）使用。

05 使用方便 成本經(jīng)濟

菌種通常以1-2mL的小份量分裝凍存于凍存管中，使用時只需取出一管進行復蘇，無反復傳代或劃線操作，既降低了污染風險，也減少了菌種變異的可能。與液氮保存或商業(yè)化菌種保藏服務相比，甘油冷凍保藏法的成本更低，具有較高的性價比。

PART 02

細菌甘油冷凍保藏操作流程

Operating procedure

所有操作必須在無菌條件下進行，建議在生物安全柜或超凈工作臺中進行。

01 準備工作

配制50% (v/v) 的無菌甘油溶液是首要步驟。將50mL分析純甘油（建議進行高壓滅菌或0.22μm濾膜過濾除菌處理）與50mL無菌蒸餾水（也可用生理鹽水或培養(yǎng)基）充分混合。盡管甘油本身具有一定抑菌性，但為確保溶液無菌，滅菌或過濾除菌操作必不可少。

02 菌種準備

平板法

使用無菌棉簽或接種環(huán)，從新鮮、健康且處于對數(shù)生長后期的平板上挑取適量菌苔（約豌豆大?。?，將其懸浮于0.5 - 1mL無菌生理鹽水或相應液體培養(yǎng)基中，制成濃菌懸液。

液體培養(yǎng)法

將菌種接種到合適的液體培養(yǎng)基（如 LB 肉湯）中，在適宜條件下振蕩培養(yǎng)，當菌液 OD600 達到 0.6 - 1.0 左右（不同菌種略有差異），即菌體處于對數(shù)生長后期時，可用于保藏。此階段的菌體生長狀態(tài)良好，保藏成功率更高。

03 菌液與甘油混合

將制備好的濃菌懸液或對數(shù)期菌液與無菌的50%甘油溶液混合，使最終甘油濃度保持在15% - 20% (v/v) 。例如，取0.6mL 50%甘油與1.4mL菌液混合，可得到2mL含15%甘油的菌懸液；取0.8mL 50%甘油和1.2mL菌液混合，則可獲得2mL含20%甘油的菌懸液?；旌蠒r需輕柔地上下顛倒或渦旋，確保菌液與甘油充分混勻。

04 分裝與標記

迅速將混合均勻的菌液-甘油混合物分裝到無菌的冷凍保存管中，每管分裝 0.5 - 1.0mL 。同時，在管壁和管蓋上清晰標明菌株名稱 / 編號、保存日期、甘油濃度、操作者姓名等信息，以便后續(xù)準確取用和管理。

愛津生物提供多規(guī)格的凍存管，全部采用進口醫(yī)療級聚丙烯（PP）材質，具有極高的透明度、無毒無味，同時具備優(yōu)異的密封性和耐化學性。它不僅能承受121℃/15psi的高溫高壓滅菌，還能在-196℃至121℃的溫度范圍內保持穩(wěn)定，確保實驗安全使用。

05 冷凍保存

可先將凍存管放入-20°C冰箱預冷1-2小時，隨后轉移至-80°C超低溫冰箱進行速凍；也可使用專門的程序降溫盒（如Mr. Frosty）。需避免緩慢冷凍（如在-20°C直接凍存過夜），因為緩慢冷凍會形成較大冰晶，對細胞造成損傷。若需長期保存，可將凍存管置于液氮氣相環(huán)境中，但應避免反復凍融。

PART 03

菌種復蘇

Strain resuscitation

01 快速解凍

從-80°C冰箱取出目標凍存管后，立即放入37°C水浴（或適合菌種生長溫度的水?。┲?，輕輕搖晃，使冰晶在30秒到1分鐘內完全融化。避免室溫緩慢融化，以防活性降低。

02 消毒與接種

用70%酒精擦拭凍存管外壁進行消毒，在無菌環(huán)境下打開管蓋，使用無菌吸頭或接種環(huán)取少量解凍菌液（通常1-2環(huán)或10-50μL），劃線接種到合適的固體平板培養(yǎng)基上，然后在適宜條件下培養(yǎng)。需注意的是，解凍后的菌液不宜再次冷凍，每次使用需取新凍存管，以保證菌種質量。

PART 04

注意事項

Points for Attention

01 嚴格無菌操作

無菌操作是保藏成功的關鍵，任何環(huán)節(jié)的污染都可能導致保藏失敗。

02 控制甘油濃度

15%-20%是常用的甘油濃度范圍，但不同菌株可能需要優(yōu)化。濃度過低，保護效果不足；濃度過高（超過25%），可能導致細胞因滲透壓失衡而脫水。

03 選擇合適的菌齡

務必使用對數(shù)生長后期的健康菌體，衰老期的細胞存活率較低，會影響保藏效果。

04 把控冷凍解凍速度

快速冷凍（-80℃直接凍或程序降溫）和快速解凍能夠顯著提高菌種存活率，緩慢操作會對細胞造成不可逆的損傷。

05 穩(wěn)定保存環(huán)境

-80℃是標準保存溫度，應盡量減少冰箱開關次數(shù)，避免溫度波動。若條件允許，液氮保存效果更佳，但成本相對較高。

06 考慮菌株特性

并非所有微生物都適合甘油保藏，部分對低溫或滲透壓敏感的菌株（如某些古菌、專性厭氧菌、部分病原菌），需要采用特殊方法或保護劑，并嚴格遵守生物安全規(guī)定，在相應級別的生物安全實驗室進行操作。

PART 05

高質量保藏，從耗材選擇開始

Consumables Selection

菌種保藏不僅考驗操作規(guī)范性，也依賴于高品質的實驗耗材。凍存管、移液吸頭、試劑瓶等耗材的性能，將直接影響菌種的活性與后續(xù)實驗的可重復性。

自2009年成立以來，愛津生物專注于實驗室耗材研發(fā)與生產(chǎn)！目前產(chǎn)品體系已涵蓋900余種品類，全面覆蓋菌種保存、分子實驗、細胞培養(yǎng)等科研場景，持續(xù)為全球科研機構提供穩(wěn)定可靠的實驗耗材整體解決方案。